解惑练 4 PCR 技术拓展应用
应用 1：反向 PCR 测定未知 DNA 区域
当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向 PCR 技
术。原理：用限制性内切核酸酶切割该 DNA，随后使用 DNA 连接酶将获得的酶切产物环化，
这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状 DNA 分子。以该已知序列为模板设计一
对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩
增出未知序列。
应用 2：PCR 定点突变技术
该技术要使用四条引物。其中引物 2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，
而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物 1和2，引物 3
和4进行 PCR 后，得到的 DNA 片段可以通过引物 2和3互补的碱基杂交在一起，再在 DNA
聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的 DNA 片段。最后，用引物 1和4进行扩增得到
含有突变位点的 DNA 片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
应用 3：(实时)荧光定量 PCR(RT－PCR)
先从样本中提取 RNA，RNA 中可能有新冠病毒的 RNA，同时也存在很多采样患者的组
织和存在于采样部位的微生物的 RNA。通过逆转录酶将样本的 RNA 逆转录为 cDNA，并进
行PCR 扩增，在 PCR 反应体系中，包含一对特异性引物以及一个 Taqman 探针，该探针为
一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报
告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR 反应时探针与模板
结合，DNA 聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发
出荧光。每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子产生。荧光定量 PCR 仪能够监测出荧光到
达预先设定阈值的循环数(Ct 值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct 值越小(如图)。
